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瓊脂糖凝膠電泳遷移速率的影響因素
  • 發布日期:2021-08-26     信息來源:      瀏覽次數:220
    • 那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關于瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程:

      1、 DNA的分子大小及構型:

      不同構型DNA的移動速度次序為:共價閉環DNAcovalently closed circularcccDNA>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。當瓊脂糖濃度太高時,環狀DNA(一般為球形)不能進入膠中,相對遷移率為0Rm=0),而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(Rm>0),由此可見,這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度。

       

      2 瓊脂糖濃度:

      一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kbDNA段所需膠濃度是 1.2-1.5%,分離大于10kbDNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%DNA段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%

       

      3、 DNA分子的構象 

      DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動*快,而線狀雙鏈DNA移動*慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因 為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種 DNA

       

      4 電源電壓 

      瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明,在低濃度、低電壓下,分離效果較好。在低電壓條件下,線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是,在電場強度增加時,不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kbDNA段的分辨率達到*大電場強度不宜高于5V/cm

       

      5 嵌入染料的存在 

      熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15%。

       

      6 離子強度影響 

      電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率*小,幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高并明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[EDTA (pH8.0)Tris-乙酸]TBE(Tris-硼酸和EDTA)TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲于室溫。

       

      以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結關于瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程。

       

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