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蛋白純化系統中親和純化常見問題我們如何解決?
  • 發布日期:2021-08-23     信息來源:      瀏覽次數:502
    • 那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關于蛋白純化系統中親和純化常見問題我們如何解決?

      感謝使用上海金鵬蛋白純化系統Blupadstart進行蛋白純化分離實驗。
      1. 鎳柱使用中出現棕色是怎么回事?
      出現這樣的情況,主要是緩沖液中 DTT 的影響, DTT 會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在堿性的緩沖液條件下鎳離子會被 DTT 還原生成
      棕色的沉淀,所以所有鎳柱的生產商都強調要盡量避免 DTT 的參與(一般的鎳柱耐受小于 5mM DTT,推薦緩沖液中不要超過2mM DTT)。
      2. 通過 His 標簽純化的蛋白,雜帶比較多,如何改進?
      (1)如果蛋白純化的是上清,蛋白酶會部分降解目的蛋白,可通過加多種蛋白酶控制劑改進。
      (2)可提高雜蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度,以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。
      (3)雜蛋白和目的蛋白結合,可通過超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
      3. 鎳柱堵了怎么辦?
      (1)柱子發生堵塞,可能是樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致,所以樣品一定要高速離心。
      (2)上清純化時,蛋白發生變性,有絮狀物產生,趕緊加入 1-2mM DTT (上清樣品處理要在冰浴中進行),還不行加尿素變性,使其在變形環境下。
      (3)樣品處理時的料液比不要太小,否則黏度大,或者導致蛋白析出或變性,料液比要在1/10-1/15 之間較適宜。
      4. 純化過程中,蛋白出現了渾濁,怎么辦?
      (1)出現渾濁,說明蛋白處在不穩定的環境中或者自身就不穩定,所以要檢查緩沖體系是否正確,環境是否低溫,或在緩沖液中加入還原劑 DTT。
      (2)加入肌氨酸鈉,迅速使蛋白變性,消除渾濁現象。
      5. 如何處理樣品,可使其初步提純(如何洗去蛋白的自身帶)?
      (1)上清樣品處理,要加入去污劑,蛋白酶控制劑,還原劑,還要注意溫度及超聲破碎的參數。
      (2)去大腸桿菌自身帶(兩條 30KD-40KD)可用非變性緩沖液超聲懸浮(加入去垢劑),離心 6000r/min,30min,10℃。(若效果不夠可繼續上述步驟)。
      (3)大腸桿菌包涵體的洗滌,可用包涵體洗液多洗幾遍,也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解,可選取其中純度較佳的。
      (4)可用硫酸銨沉淀法,初步提純。
      6. 蛋白掛在柱子上洗脫不下來,怎么解決?
      (1)洗脫條件太溫和(組氨酸標記的蛋白質仍然結合在柱上,結合力較強) 策略:用增加咪唑的梯度洗脫或降低 pH 來找出較佳的洗脫條件。
      (2)降低 PH 的方法洗脫的,因 為若 PH 低于 3.5,會導致鎳離子脫落 策略:改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫
      (3)蛋白已沉淀在柱上 策略:減少上樣量和孵育的時間,試用去污劑(1%-2%Tritonx-100)或改變 NaCl 的濃度,或在變性條件下洗脫(用 8M 脲,或 6M 鹽酸胍),也可在洗脫 Buffer中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸鈉進行洗脫。
      (4)非特異性疏水或其他相互反應 策略:加非離子去污劑到洗脫緩沖液(如,2%Triton X-100)或增加 NaCl 的濃度。
      7. 沒能純化到帶 His 標簽的蛋白,蛋白都流穿了(未掛柱)?
      (1)超聲的功率不對(太大,蛋白炭化,太小,蛋白沒有釋放) ;
       策略:改變超聲功率,并在超聲前加入溶菌酶。
      (2)樣品或者是結合緩沖液不正確 ;
      策略:檢測 pH 及樣品和結合緩沖液的組成份(EDTA)。
      (3)組氨酸的標簽沒有完全的暴露 ;
       策略:在變性條件下(用 8M 脲,6M 鹽酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 進行純化。
      (4)His 標簽丟失;
      策略 1:WB 或者 anti-his 的抗體檢查 His 是否表達,上游構建,改變his-tag 的位(C-terminal or N-terminal),必要時增加 his 個數(常用 6-10 個);
      策略 2:孵育的時間不夠,降低流速和增加孵育的時間;
      策略 3:改變螯合的金屬離子,尋找到較佳的結合金屬離子。
      Ni2+通常是從宿主細胞蛋白中純化大多數(組氨酸)6 標記的重組蛋白質的金屬離子,也是一般常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結合強度受幾種因素影響,包括長度、位置、親和標記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的 pH,因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進行純化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 來篩選不同的金屬離子。

      以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結關于蛋白純化系統中親和純化常見問題我們如何解決?

       

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